Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на методы испытания специфической активности пробиотических производственных штаммов и пробиотиков на их основе, которая определяется количеством жизнеспособных бактерий и активностью кислотообразования или их антагонистической активностью по отношению к тест-штаммам.
Таким образом, описанные в настоящей статье микробиологические методы позволяют определить следующие показатели специфической активности испытуемого препарата или штамма:
- количество жизнеспособных бактерий в 1 дозе иммунобиологического лекарственного препарата (ИЛП) (раздел 1);
- активность кислотообразования (раздел 2);
- антагонистическая активность (раздел 3).
Требования к специфической активности испытуемого препарата касаются определения количества живых бактерий в 1 дозе лекарственного средства, кислотообразующей активности штаммов-продуцентов, входящих в лакто- и бифидосодержащие пробиотики для медицинского применения, и определения уровня антагонистической активности испытуемого препарата. Контроль испытуемого препарата по показателю "Количество жизнеспособных бактерий в одной дозе лекарственного средства" является обязательным при отработке новых технологий производства лекарственного средства, предварительном и сертификационном контроле, оценке качества и проверке стабильности лекарственных форм в процессе установления срока годности. Определение количества живых микроорганизмов в испытуемой дозе проводят методом серийных разведений, при необходимости, с последующим высевом на питательные среды (Человеческая доза - доза испытуемого препарата, указанная на этикетке или в инструкции по медицинскому применению (листке-вкладыше)).
При проведении контроля поликомпонентных или комбинированных пробиотиков необходимо учитывать количество и соотношение всех видов или штаммов, входящих в состав препарата.
Показатель "Активность кислотообразования" является обязательным при контроле штаммов-продуцентов, входящих в состав лакто- и бифидосодержащих пробиотиков, при предварительном и сертификационном контроле, при оценке качества и проверке стабильности лекарственных форм в процессе установления срока годности.
Показатель "Антагонистическая активность" является обязательным при контроле колисодержащих и споровых пробиотиков для медицинского применения и производственных штаммов. Уровень антагонистической активности ИЛП в отношении штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов определяют методом отсроченного антагонизма на плотной среде по зонам задержки роста тест-штаммов.
Производственные штаммы контролируются не реже 1 раза в год.
Для выращивания микроорганизмов, входящих в пробиотики для медицинского применения, используют адекватную для данного вида бактерий и для данной методики питательную среду (если нет других указаний в нормативной документации):
- для лактобактерий - МРС-2, МРС-4, МРС-5, МРС-1; для ацидофильных лактобактерий - стерильное обезжиренное молоко;
- для бифидобактерий - полужидкую модифицированную печеночную среду Блаурокка, среду Блаурокка с натрия азидом, МРС-5;
- для кишечной палочки - среду Эндо, мясопептонный агар (МПА), среду Гаузе N 2 агаризованную;
- для энтерококков - МПА, среду N 1;
- для бактерии рода Bacillus - среду Гаузе N 2 агаризованную, МПА, полусинтетическую среду с дрожжевым диализатом.
Питательные среды для проведения испытаний готовят в соответствии с приведенными ниже указаниями. Также могут использоваться эквивалентные коммерчески доступные среды при условии, что они выдерживают испытания на ростовые свойства. Необходимое значение рН питательных сред устанавливают при температуре 
.
В 200 мл воды очищенной последовательно растворяют:
| - | марганец сернокислый | 0,05 г |
| - | цистеин солянокислый или L-цистин | 0,10 г |
| - | магний сернокислый | 0,200 г |
| - | калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный | 2,00 г |
| - | аммония цитрат | 2,00 г |
| - | натрия ацетат (натрий уксуснокислый) | 5,00 г |
| - | печеночный экстракт* (1:1) | 100,0 мл |
| - | дрожжевой аутолизат** с содержанием | |
| - | аминного азота | 50,0 мл |
| - | пептон сухой ферментативный | 10,00 г |
| - | гидролизат обезжиренного молока*** | 500,0 мл |
| - | полисорбат 80 | 1,00 мл |
| - | глюкоза | 20,00 г |
Доводят объем среды водой очищенной до 1000 мл; рН среды (6,4 ± 0,2) . Питательную среду разливают в пробирки по 10 , 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре 
С в течение (15 ± 1) мин. Срок хранения готовой стерильной среды 2 мес при температуре от 2 до 8°С или не более 1 мес при температуре от 18 до 25°С.
Примечание.
* Приготовление печеночного экстракта с содержанием аминного азота (0,05 ± 0,005)% .
| - | Печень говяжья | 1,0 кг |
| - | Вода очищенная | 1000 мл |
Стерилизация в автоклаве при температуре 
в течение (20 ± 1) мин (процесс стерилизации валидируется).
Приготовление: 1,0 кг свежей говяжьей печени очищают от жира, пленок и протоков, нарезают кубиками размером (3х3х3) см, заливают 1 л воды очищенной и кипятят в течение 1,5-2 ч. Остывший отвар фильтруют через марлевый фильтр (ткань "миткаль"), количество отвара доводят водой очищенной до 1 л, разливают в бутыли и стерилизуют при температуре 120±2°C в течение 15 ± 1 мин. Срок хранения печеночного экстракта при температуре от 2 до 8°С не более 6 мес или не более 3 мес при комнатной температуре.
** Приготовление дрожжевого аутолизата с содержанием аминного азота (0,15 ± 0,03)% .
| - | Дрожжи хлебопекарные | 1000 г |
| - | Вода питьевая | 4000 мл |
| - | Хлороформ | 40 мл |
Стерилизация в автоклаве при температуре в течение (20 ± 1) мин.
*** Приготовление гидролизата обезжиренного молока по Богданову.
| - | Молоко коровье пастеризованное, нежирное (рН 6,7 ± 0,1 ) | 1000 мл |
| - | Панкреатин | 1,0 г |
| - | Хлороформ | 5,0 мл |
Стерилизация в автоклаве при температуре в течение (20 ± 1) мин.
| - | Марганец сернокислый | 0,05 г |
| - | Цистеин солянокислый или L-цистин | 0,10 г |
| - | Магний сернокислый | 0,20 г |
| - | Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный | 2,00 г |
| - | Аммония цитрат | 2,00 г |
| - | Натрия ацетат | 5,00 г |
| - | Печеночный экстракт (1:1) | 100,0 мл |
| - | Дрожжевой аутолизат с содержанием аминного азота | 50,0 мл |
| - | Пептон сухой ферментативный | 10,00 г |
| - | Гидролизат обезжиренного молока | 500,0 мл |
| - | Полисорбат 80 | 1,00 мл |
| - | Глюкоза | 20,00 г |
| - | Агар микробиологический | 1,00 г |
| - | Вода очищенная | до 1000 мл |
Значение рН готовой среды (6,4 ± 0,2) . Питательную среду разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют при температуре в течение (15 ± 1) мин. Срок хранения питательной среды 2 мес при температуре от 2 до 8°С или не более 1 мес при температуре от 18 до 25°С.
В 200 мл воды очищенной последовательно растворяют:
| - | Марганец сернокислый | 0,05 г |
| - | Цистеин солянокислый или L-цистин | 0,10 г |
| - | Магний сернокислый | 0,200 г |
| - | Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный | 2,00 г |
| - | Аммония цитрат | 2,00 г |
| - | Натрия ацетат | 5,00 г |
| - | Печеночный экстракт (1:1) | 100,0 мл |
| - | Дрожжевой аутолизат с содержанием аминного азота | 50,0 мл |
| - | Пептон сухой ферментативный | 10,00 г |
| - | Гидролизат обезжиренного молока | 500,0 мл |
| - | Полисорбат 80 | 1,00 мл |
| - | Глюкоза | 20,00 г |
| - | Агар микробиологический | 19,0 г |
Доводят объем среды водой очищенной до 1000 мл (рН 6,4 ± 0,2 ). Питательную среду стерилизуют в автоклаве при температуре в течение (15 ± 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8°С в стерильных герметичных флаконах или не более 3 мес при температуре от 18 до 25°С.
| - | Марганец сернокислый | 0,05 г |
| - | Цистеин солянокислый или L-цистин | 0,10 г |
| - | Магний сернокислый | 0,200 г |
| - | Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный | 2,00 г |
| - | Печеночный экстракт (1:1) | 100,0 мл |
| - | Дрожжевой аутолизат с содержанием аминного азота | 50,0 мл |
| - | Пептон сухой ферментативный | 10,00 г |
| - | Гидролизат обезжиренного молока | 500,0 мл |
| - | Полисорбат 80 | 1,00 мл |
| - | Глюкоза | 20,00 г |
| - | Агар микробиологический | 15,0 г |
| - | Вода очищенная | до 1000 мл. |
Питательную среду (рН 7,0) стерилизуют в автоклаве при температуре в течение (15 ± 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8°С в стерильных герметичных контейнерах (флаконах) или не более 3 мес при температуре от 18 до 25°С.
Примечание.
Приготовление обезжиренного стерильного молока рН (6,7 ± 0,3) ;
показатель кислотности не более 18°Т:
| - | Молоко сухое обезжиренное | 80 г |
| - | Вода очищенная | до 1000 мл |
Разливают в пробирки по 10, 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре в течение (15 ± 1) мин (процесс стерилизации валидируется). Срок хранения обезжиренного стерильного молока 2 мес при температуре от 2 до 8°С или не более 1 мес при температуре от 18 до 25°С.
| - | Печеночная вода (1:2) с содержанием аминного азота (100 ± 20) мг % | 1000 мл |
| - | Пептон сухой | 10 г |
| - | Натрия хлорид | 5 г |
| - | Лактоза | 10 г |
| - | Цистеин | 0,1 г |
| - | Агар микробиологический | 0,75 г |
Устанавливают требуемое значение рН (7,2 ± 0,2) с помощью 20% раствора натрия гидроксида. Питательные среды разливают в пробирки по 10, 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре в течение (60 ± 1) мин (процесс стерилизации валидируется). Срок хранения питательной среды 2 мес при температуре от 2 до 8°С или не более 1 мес при температуре от 18 до 25°С. После 14 сут хранения перед использованием для снижения содержания растворенного кислорода среду следует однократно регенерировать путем нагревания пробирок на водяной бане при температуре 70-80°С в течение 10-15 мин.
Примечание.
Приготовление печеночной воды с содержанием аминного азота (100 ± 20) мг %.
| - | Печень говяжья | 0,5 кг |
| - | Вода очищенная | 1000 мл |
Стерилизация в автоклаве при температуре в течение (20 ± 1) мин (процесс стерилизации валидируется).
0,5 кг свежей говяжьей печени очищают от жира, пленок и протоков, нарезают кубиками размером (3х3х3) см, заливают 1 л воды очищенной и кипятят в течение 1,5-2 ч. Остывший отвар фильтруют через марлевый фильтр (ткань "миткаль"), количество отвара доводят водой очищенной до 1 л, разливают в бутыли и стерилизуют при температуре в течение (20 ± 1) мин. Срок хранения - не более 6 мес при температуре от 2 до 8°С или не более 3 мес при температуре от 18 до 25°С.
| - | Среда Блаурокка | 1000 мл |
| - | Натрия азид | 0,1 г |
Среду перемешивают, разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют при температуре в течение (20 ± 1) мин. Срок хранения питательной среды 1 мес при температуре от 2 до 8°С.
| - Бульон Xоттингеpa* с содержанием аминного азота 700 мг % | 30 мл |
| - Пептон сухой | 5 г |
| - Натрия хлорид | 5 г |
| - Глюкоза | 10 г |
| - Агар микробиологический | 30 г |
| - Вода очищенная | до 1000 мл |
Примечание.
* Приготовление бульона Хоттингера (содержание аминного азота 700 мг %).
| - Гидролизат Хоттингера | 24,0 г |
| - Натрия хлорид | 5,0 г |
| - Вода очищенная | до 1000 мл |
Стерилизация в автоклаве при температуре в течение (20 ± 1) мин. Срок хранения питательной среды в течение 6 мес при температуре от 2 до 8°С в стерильных герметичных контейнерах (флаконах).
| - | Марганец хлористый 4-водный или марганец сернокислый | 0,01 г |
| - | Железо(III) сернокислое 7-водное | 0,01 г |
| - | Магний сернокислый 7-водный или магния хлорид 6-водный | 0,1 г |
| - | Кальция хлорид | 0,08 г |
| - | Пептон сухой | 0,5 г |
| - | Дрожжевой диализат с содержанием азота аминного 150 мг % | 5,0 мл |
| - | Глюкоза | 10,0 г |
| - | Агар микробиологический | 20-30 г |
| - | Вода очищенная | до 1000 мл. |
Стерилизация в автоклаве при температуре в течение (20 ± 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8°С в стерильных герметичных контейнерах (флаконах).
| - | Пептон | 10,0 г |
| - | Натрия хлорид | 5,0 г |
| - | Мясная вода | 300-500 мл |
| - | Агар микробиологический | 13-20 г |
В мясную воду вносят 10 г пептона и 5 г натрия хлорида, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный бульон фильтруют, устанавливают рН 7,2-7,4 и добавляют измельченный агар в количестве, зависящем от его качества и назначения среды. После добавления агара среду кипятят на слабом огне при постоянном перемешивании до полного растворения агара. Разливают в пробирки и флаконы, стерилизуют при температуре 120°С в течение (20 ± 1) мин. После стерилизации среда, остывая, уплотняется.
Срок хранения готовой среды (рН 7,3 ± 0,2 ) 6 мес при температуре от 2 до 8°С или не более 1 мес при температуре от 18 до 25°С.
| - | Пептон | 10,0 г |
| - | Натрия хлорид | 5,0 г |
| - | Мясная вода | 1000 мл. |
В мясную воду вносят 10 г пептона и 5 г натрия хлорида, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный бульон фильтруют, устанавливают рН 7,2-7,4 и разливают в пробирки и флаконы. Стерилизуют при температуре 120°С в течение (20 ± 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8°С или не более 1 мес при температуре от 18 до 25°С
Примечание.
Приготовление мясной воды (1:2).
| - | Мясо-говядина (фарш) | 500 г |
| - | Вода очищенная | 1000 мл |
Стерилизация при температуре 121°С в течение 20 мин. Срок хранения 2 мес при температуре от 2 до 8°С и не более 1 мес при температуре от 18 до 25°С.
Перед испытанием, в случае использования плотной питательной среды, по 10-15 или 20-25 мл расплавленной агаризованной питательной среды (при температуре около 45°С) разливают в стерильные чашки Петри диаметром 9 или 12 см (соответственно), оставляют на горизонтальной поверхности и дают среде застыть. Поверхность агаризованных сред перед посевом подсушивают для удаления конденсационной воды и проверки стерильности. Чашки Петри с питательными средами помещают закрытыми и перевернутыми вверх дном в термостат при температуре 
на 48 ч. Агар Эндо подсушивают 40 мин в ламинарном шкафу с открытыми крышками.
В настоящем разделе изложены общие принципы определения количества живых бактерий в пробиотиках для медицинского применения методом десятикратных разведений с высевом на плотные питательные среды (метод Коха) и глубинного чашечного метода или в жидкие и полужидкие среды (метод предельных разведений). Результаты количественного определения микроорганизмов выражаются в колониеобразующих единицах (КОЕ).
От каждой испытуемой серии препарата пробиотика методом случайной выборки отбирают по 3 испытуемых образца.
Испытания проводят, соблюдая правила асептики.
Каждый образец в отдельности разводят стерильным 0,9% раствором натрия хорида и перемешивают пипеткой 8-10 раз.
Особенности подготовки испытуемого образца в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в нормативной документации):
1. Лиофилизаты (флаконы) - каждый образец в отдельности ресуспензируют стерильным 0,9% раствором натрия хлорида (из расчета 1 мл на 1 дозу) и перемешивают пинеткой 8-10 раз, получая исходное разведение.
2. Порошки - содержимое пакета (саше) асептически пересыпают в стерильную колбу вместимостью 250 мл, добавляют 100 мл 0,9% раствора натрия хлорида и перемешивают путем энергичного встряхивания в течение 10 мин, получая разведение 1:100 
.
3. Таблетки - каждый образец в отдельности предварительно растирают в стерильной ступке стерильным пестиком до гомогенного состояния и дробно добавляют 0,9% раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8-10 раз, получая исходное разведение.
4. Капсулы - каждый образец в отдельности вносят в стерильные пробирки, добавляют 10 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Пробирки с капсулами помещают на водяную баню при температуре 
. Через 10-30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния, получая разведение 1:10 
.
5. Суппозитории - каждый образец в отдельности помещают в стерильные пробирки и добавляют предварительно нагретый до температуры стерильный 0,9% раствор натрия хлорида до общего объема 10 мл в зависимости от величины средней массы суппозитория испытуемой серии (например, при массе 1,1 г добавляют 8,9 мл 0,9% раствора натрия хлорида, а при массе 2 г - 8 мл физиологического раствора). Пробирки с суппозиториями помещают на водяную баню при температуре . Через 10-30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния, получая разведение 1:10 .
Испытание проводят методом последовательных десятикратных разведений, соблюдая правила асептики. Для этого 1 мл микробной суспензии испытуемого образца (исходное разведение, разведения 
или 
) вносят пипеткой в пробирку, содержащую 9 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Затем новой пипеткой 10-15 раз перемешивают, получая следующее разведение ( или 
), и затем 1 мл суспензии переносят в следующее разведение. Титрование проводят до разведений, из которых будет произведен высев на питательные среды. Для каждого разведения используют отдельную пипетку.
В случае, если образец содержит 1 дозу, 0,5 мл микробной суспензии испытуемого образца (исходное разведение) пипеткой вносят в пробирку, содержащую 4,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Затем новой пипеткой 10-15 раз перемешивают, получая следующее разведение и 1 мл суспензии переносят в пробирку с 9 мл 0,9% раствора натрия хлорида, получая разведение . Титрование проводят до разведений, из которых будет произведен высев на питательные среды. Для каждого разведения используют отдельную пипетку.
В зависимости от биологических свойств бактерий, входящих в состав испытуемого образца, используют соответствующую методику испытания.
В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из 2 последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в 1 дозе исследуемого препарата) по 0,1 мл микробной суспензии высевают на чашки Петри с питательной средой (по 2 чашки на каждое разведение). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды шпателем Дригальского или с помощью стеклянных бус до полного впитывания (высыхания) суспензии. Чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации.
Посевы инкубируют при температуре в течение 24-96 ч в адекватных, в зависимости от вида микроорганизма, условиях (аэробных, микроаэрофильных или анаэробных). При инкубировании в анаэробных или микроаэрофильных условиях чашки Петри с посевами помещают в анаэростат и создают необходимую газовую атмосферу.
Данный метод может быть использован при определении количества живых бактерий каждого вида в поликомпонентных пробиотиках при условии, что бактерии, входящие в состав препарата, образуют визуально различимые по форме и другим признакам колонии.
В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из 2 последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в исследуемом препарате) по 1,0 мл микробной суспензии стерильной пипеткой вместимостью 1,0 мл вносят в чашки Петри диаметром 90 мм (по 2 чашки на каждое разведение). Добавляют 20-25 мл расплавленной и охлажденной до температуры 
агаризованиой питательной среды, закрывают и быстро осторожно перемешивают вращательно-поступательными движениями, не отрывая дна чашки от поверхности стола и не допуская попадания среды на крышку чашки. После застывания агара чашки Петри переворачивают вверх дном и инкубируют в адекватных условиях при температуре в течение необходимого для данного микроорганизма времени.
По окончании инкубации производят подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе испытуемого образца. При подсчете учитывают чашки, на которых выросло не менее 15 колоний.
Пример расчета содержания живых микробных клеток в 1 дозе испытуемого образца:
- из разведения 
выросло 42 и 45 колоний; среднее арифметическое равно (42 + 45) : 2 = 43,5;
- из разведения 
выросло 410 и 450 колоний; среднее арифметическое равно (410 + 450) : 2 = 430;
- количество живых бактерий в 1 дозе равно:
.
Умножают среднюю арифметическую числа колоний на степень разведения и в том случае, если высев на чашку Петри сделан в объеме 0,1 мл, умножают на коэффициент 10 для пересчета на 1,0 мл.
В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца , , 
, 
(степень разведения зависит от количества КОЕ в испытуемом образце) высевают по 1 мл микробной суспензии от каждого разведения в 2 пробирки с 9 мл стерильного обезжиренного молока. Отмечают, из какого именно разведения сделан посев. Разведение препарата в 0,9% растворе натрия хлорида соответствует разведению в молоке. Для контроля среды добавляют 4 незасеянные пробирки с молоком. Засеянные и контрольные пробирки инкубируют при температуре 
в течение 3-4 сут.
По окончании инкубации определяют количество пробирок со свернувшимся молоком. Из сгустка с культурой готовят мазки и окрашивают по Граму. Если в мазках видны характерные бактерии и отсутствует посторонняя микрофлора, то данное разведение учитывают, как содержащее микроорганизмы данного вида. В случае сквашивания молока в контрольных пробирках и при обнаружении посторонней микрофлоры в мазках, контроль проводят на новой партии среды.
При подсчете количества живых особей используют таблицу Мак-Креди (табл. 1). Сначала составляют числовую характеристику. Она состоит из 3 цифр: на первое место (слева) ставят цифру, равную числу пробирок со свернувшимся молоком, взятых в том последнем разведении, где молоко свернулось во всех пробирках (например, 2 пробирки разведения ).
Следующие две цифры обозначают число пробирок со свернувшимся молоком в 2 последующих разведениях (например, в 1 пробирке разведения и в 1 пробирке разведения ).
Числовая характеристика результата будет 211.
По таблице Мак-Креди находят вероятное число, соответствующее полученной цифровой характеристике (в нашем случае 13), умножают его на разведение, которому соответствует первая цифра числовой характеристики (в данном примере - ). Тогда количество живых особей микроорганизмов в 1 дозе составляет 
.
Таблица 1 - Таблица Мак-Креди, используемая при подсчете количества живых ацидофильных лактобактерий
| Числовая характеристика | Наиболее вероятное число микроорганизмов при посеве в 2 параллельные пробирки |
| 200 | 2,5 |
| 201 | 5,0 |
| 202 | - |
| 210 | 6,0 |
| 211 | 13,0 |
| 212 | 20,0 |
| 220 | 25,0 |
| 221 | 70,0 |
Из разведений препарата , , , , 
(степень разведения зависит от количества КОЕ в испытуемом образце) высевают по 1 мл микробной суспензии в пробирки, содержащие 9 мл полужидкой питательной среды. Отмечают, из какого именно разведения сделан посев. Разведение препарата в 0,9% растворе натрия хлорида соответствует разведению в питательной полужидкой среде.
Посевы инкубируют при температуре в зависимости от вида микроорганизма в течение 1-6 сут. По окончании инкубации отмечают разведения, в которых имеется рост типичных колоний для данного вида микроорганизмов.
В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца в полужидкой питательной среде должно наблюдаться 10-кратное уменьшение количества колоний микроорганизмов.
Количество живых бактерий в дозе испытуемого препарата вычисляют путем умножения количества колоний в пробирке на величину разведения микробной суспензии в данной пробирке (объем вносимого материала в 1,0 мл дает коэффициент умножения 1, который не влияет на конечный результат при вычислении).
Для определения количества живых бактерий в составе препарата пробиотика из соответствующих последовательных десятикратных разведений испытуемого образца в 0,9% растворе натрия хлорида (с по ) проводят высевы на среду Блаурокка с натрия азидом (учет бифидобактерий) и на среду Эндо (учет колибактерий).
Для определения количества бифидобактерий по 1 мл микробной суспензии из разведений , , , высевают в пробирки, содержащие 9 мл полужидкой питательной среды Блаурокка с азидом натрия (отмечая разведение, из которого сделан посев). При этом учитывают, что разведение препарата в 0,9% растворе натрия хлорида соответствует разведению в среде Блаурокка с азидом натрия. Посевы в среде Блаурокка с азидом натрия инкубируют при температуре в течение 4-5 сут.
Для определения количества кишечных палочек делают посев по 0,1 мл микробной суспензии из разведений испытуемого образца 
, на чашки Петри со средой Эндо (по 2 чашки от каждого разведения). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды Эндо шпателем Дригальского до полного впитывания (высыхания) суспензии. Чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре в течение 18-24 ч.
В среде Блаурокка с натрия азидом по окончании инкубации отмечают разведения, в которых имеется рост колоний в виде "гвоздиков". Количество живых бактерий в дозе вычисляют путем умножения количества колоний в пробирке на величину разведения микробной суспензии в данной пробирке.
На среде Эндо по окончании инкубации производят подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе препарата. При подсчете учитывают чашки, на которых выросло не менее 15 колоний. Пример для расчета аналогичен описанному в подразделе 1.
Кислотообразующую активность штаммов-продуцентов, входящих в состав лакто- и бифидосодержащих пробиотиков для медицинского применения определяют по титруемой кислотности при культивировании бактерий в адекватной питательной среде. Испытание количественного определения кислотообразующей активности проводят методом кислотно-основного титрования.
Для выращивания бифидобактерий используют полужидкую модифицированную печеночную среду Блаурокка, для лактобактерий - МРС-1 или стерильное обезжиренное молоко, если нет других указаний в нормативной документации.
Реактивы, используемые в испытании:
- титрованный 0,1 М раствор натрия гидроксида;
- индикатор - 1% раствор фенолфталеин.
От каждой испытуемой серии лекарственного средства, независимо от ее объема, методом случайной выборки отбирают по 2 образца. В случае, если испытуемый образец (т.е. таблетка/капсула/суппозиторий) содержит 1 дозу, то в 1 образец объединяют 3 таблетки/капсулы/суппозитория.
Испытания проводят, соблюдая правила асептики.
Особенности подготовки испытуемого образца в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в нормативной документации):
1. Лиофилизаты - испытуемый образец (каждый образец в отдельности) разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу препарата и перемешивают пипеткой 8-10 раз.
По 2,5 мл полученной суспензии каждого образца вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 25 мл питательной среды. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре и инкубируют в течение 48-72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).
2. Таблетки - каждый образец в отдельности предварительно растирают (асептически) в ступке до гомогенного состояния и дробно добавляют 0,9% раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8-10 раз.
По 2,5 мл полученной суспензии каждого образца вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 25 мл питательной среды. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре и инкубируют в течение 48-72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).
3. Порошки - содержимое саше асептично пересыпают в пробирку, вместимостью 50 мл, содержащую 25 мл питательной среды, и перемешивают. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре и инкубируют в течение 48-72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).
4. Капсулы - каждый образец в отдельности вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 30 мл питательной среды адекватной для вида микроорганизма, входящего в состав препарата. Пробирки помещают на водяную баню при температуре . Через 20-30 мин полученную суспензию перемешивают до гомогенною состояния. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре и инкубируют в течение 48-72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).
5. Суппозитории - каждый образец в отдельности вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 30 мл питательной среды, адекватной для вида микроорганизма, входящего в состав препарата. Пробирки помещают на водяную баню при температуре . Через 20-30 мин полученную суспензию перемешивают до гомогенного состояния. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре и инкубируют в течение 48-72 ч (сроки инкубации определяются видом микроорганизма).
Примечание.
После окончания инкубации суспензию в пробирках освобождают от липофильной суппозиторной основы одним из следующих способов:
- сразу после окончания инкубирования при температуре посевов стерильной пипеткой удаляют растопленный верхний слой жира;
- пробирки охлаждают при температуре от 2 до 8°С в течение (20 ± 5) мин, затем застывшую суппозиторную основу снимают асептически пастеркой с загнутым концом или бактериологической петлей.
Уровень кислотообразования определяют в каждом из 2 образцов. После окончания инкубации содержимое пробирки перемешивают отдельной пипеткой 8-10 раз. Каждую пробу в объеме 10 мл вносят в отдельную коническую колбу или стакан вместимостью 100 мл.
Штаммы-продуценты, выращенные в стерильном обезжиренном молоке, образуют сгусток. Образовавшийся сгусток разбивают путем тщательного перемешивания (10-12 раз) пипеткой вместимостью 10 мл. После этого 10 мл микробной суспензии переносят из пробирки с культуральной средой в коническую колбу вместимостью 100 мл, содержащую 20 мл воды очищенной. Колбу интенсивно встряхивают для равномерною перемешивания содержимого, затем прибавляют 2-3 капли 1% раствора фенолфталеина.
Полученную суспензию титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида до появления стойкого слабо-розового окрашивания и достижения рН (8,5 ± 0,1) (контролируют потенциометрически), при этом учитывают количество миллилитров 0,1 М раствора натрия гидроксида, пошедшее на титрование.
Кислотность выражают в градусах Тернера (°Т) и вычисляют по формуле:
,
где: А - количество миллилитров 0,1М раствора натрия гидроксида, пошедшее на титрование 10 мл исследуемой микробной суспензии;
К - поправка к титру 0,1 М раствора натрия гидроксида;
10 - объем микробной суспензии, мл.
Пример расчета: на титрование 10 мл микробной суспензии пошло 10,6 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, где К = 1,03, тогда:
Вычисляют средний показатель из 2 параллельных проб от каждого образца (пробирки) и средний показатель из 2 образцов (пробирок) при условии, если показатель активности кислотообразования каждого из них был не ниже регламентированного.
Антагонистическую активность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов оценивают как у штаммов-продуцентов, так и у препаратов пробиотиков, полученных на их основе. Определение антагонистической активности штаммов-продуцентов, входящих в пробиотики для медицинского применения, проводят с помощью метода отсроченного антагонизма.
При проведении испытания применяют питательную среду, адекватную для данного вида бактерий (если нет других указаний в нормативной документации):
- для лактобактерий и бифидобактерий - среду МРС-5;
- для кишечной палочки и споровых пробиотиков - среду Гаузе N 2.
Тест-штаммы микроорганизмов, используемые в испытании, приведены в табл. 2. Их получают в лиофилизированном виде (в ампулах) из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ "НЦЭСМП" (если нет других указаний в нормативной документации) c сертификатом соответствия (паспортом на штамм).
Таблица 2 - Тест-штаммы микроорганизмов, используемых в испытаниях по отсроченному антагонизму
| Тест-штамм микроорганизма | Номер штамма |
| Staphylococcus aureus | АТСС 6538 (FDA 209P) |
| Escherichia coli | O157 |
| Shigella flexneri | 170, 337 |
| Shigella sonnei | 5063 |
| Proteus mirabilis | Н-237 или 56/10 |
| Proteus vulgaris | 177 или 401 |
| Candida albicans | ATCC10231 |
Ампулы с тест-культурами микроорганизмов вскрывают в асептических условиях в соответствии с инструкцией производителя.
Для восстановления жизнеспособности культуры необходимо не менее двух пересевов на адекватной питательной среде (соответствующей потребностям используемого микроорганизма) с инкубацией в стандартных условиях. Для получения изолированных колоний второй пересев культуры тест-штамма проводят на адекватной плотной питательной среде при инкубации в стандартных условиях.
Температура инкубации посевов бактерий 
, грибов - 
, если нет других указаний в нормативной документации.
По окончании инкубации изучают морфологию выросших колоний, микроскопируют мазки, окрашенные по Граму, изучают биохимические свойства с использованием тест-систем, разрешенных к использованию. Тест-штамм микроорганизма должен обладать типичными морфологическими, тинкториальными, культуральными, биохимическими свойствами в соответствии с представленным сертификатом коллекции.
Тест-штаммы микроорганизмов в лиофилизированном виде хранятся при температуре (6 ± 2)°C в течение 24 мес.
Допускается не более 5 пассажей от исходной культуры.
Для испытания используют культуры, выращенные в течение (22 ± 2) ч, второго или третьего пассажа, которые инкубируют на адекватной плотной питательной среде в адекватных условиях. Выросшую чистую культуру смывают 0,9% раствором натрия хлорида с поверхности плотной питательной среды. Полученную суспензию собирают в стерильную посуду (флакон, пробирку и т.д.). Доводят концентрацию микробных клеток в полученной суспензии в соответствии со стандартным образцом мутности 5 ОЕ в соответствии с ОФС "Определение концентрации микробных клеток".
Методом случайной выборки отбирают образцы от каждой серии препарата. Посевы проводятся в стерильных условиях.
Пробиотические производственные штаммы-продуценты (лиофилизаты) восстанавливают до первоначально высушенного объема (но не менее 
микробных клеток/мл), добавляя в лиофилизат стерильный 0,9% раствор натрия хлорида.
1. Лиофилизаты - разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8-10 раз.
2. Таблетки - предварительно растирают в ступке (асептически) до гомогенного состояния дробно добавляют 0,9% раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8-10 раз.
3. Порошки - содержимое пакета (саше) высыпают в пробирку, содержащую 25 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида, и перемешивают путем энергичного встряхивания в течение 10 мин.
4. Капсулы - содержимое капсулы вносят в пробирку, добавляют 1 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида и перемешивают до гомогенного состояния.
5. Суппозитории - вносят в пробирку, добавляют до общего объема 10 мл стерильный 0,9% раствор натрия хлорида, предварительно нагретый до температуры . Пробирки с суппозиториями помещают на водяную баню при температуре . Через 10-30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния и освобождают от жировой основы (как описано выше в разделе 2).
Полученную суспензию испытуемого образца перемешивают и высевают бактериологической петлей диаметром (3,5 ± 0,5) мм на 6 чашек Петри с питательной средой, проводя по 2 параллельных штриха длиной, равной диаметру чашки.
После инкубирования в течение 48-96 ч при температуре в адекватных (аэробных, микроаэрофильных или анаэробных) условиях в зависимости от вида микроорганизма к выросшей культуре испытуемого образца подсевают культуры тест-штаммов (в соответствии с требованиями нормативной документации). Подсев тест-штаммов производят петлей диаметром (1,75 ± 0,25) мм в направлении, перпендикулярном зоне роста изучаемого микроорганизма, и не касаясь его. Чашки Петри перевернутые вверх дном инкубируют при температуре в течение 18-20 ч (если нет других указаний в нормативной документации).
Контролем роста тест-штаммов служит их параллельный посев на чашки с той же питательной средой без испытуемой культуры.
Учитывают величину зоны отсутствия роста тест-штамма, выраженную в мм. Чем больше величина угнетения роста тест-культур, тем выше антагонистическая активность испытуемого штамма.
Если нет других указаний в нормативной документации, антагонистическую активность штаммов-продуцентов, входящих в пробиотики для медицинского применения, считают высокой, если:
- зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 20 мм - для штаммов-продуцентов, входящих в лактосодержащие пробиотики;
- зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 15 мм - для штаммов-продуцентов, входящих в коли-, бифидосодержащие пробиотики;
- зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 10 мм - для штаммов-продуцентов, входящих в споросодержащие пробиотики