Определение азота свободных аминогрупп в препаратах аминокислот, пептидов, белков и других с содержанием азота 1,5-5,0 мг в 1 мл испытуемого раствора проводят методом формольного титрования (метод Серенсена), основанном на защите формальдегидом свободных аминогрупп (образование оснований Шиффа) и алкалиметрическом титровании эквивалентного количества карбоксильных групп. Метод неприменим в присутствии ионов аммония, завышающих результаты определения.
Определение аминного азота в препаратах с более низким его содержанием (около 0,01-0,06 мг в 1 мл испытуемого раствора) проводят методом Попе-Стевенса. Метод основан на взаимодействии аминокислот в щелочном растворе с ионами двухвалентной меди и последующем йодометрическом титровании.
К точной навеске или точному объему (указывают в фармакопейной статье) испытуемого образца прибавляют воду до объема 20 мл. При необходимости раствор нейтрализуют потенциометрически до рН 7,0, путем прибавления натрия гидроксида раствора 0,1 М или хлористоводородной кислоты раствора 0,1 М. По окончании нейтрализации прибавляют от 2 до 10 мл (указывают в фармакопейной статье) формальдегида раствора 35%, нейтрализованного в день анализа натрия гидроксида раствором 10% до рН 760, перемешивают и титруют натрия гидроксида раствором 0,1 М до значения рН 9,1, не изменяющегося при перемешивании в течение 2 мин, или до появления слабо-розового окрашивания (индикатор - фенолфталеина раствор 1%).
Параллельно проводят контрольный опыт.
1 мл натрия гидроксида раствора 0,1 М соответствует 1,4 мг аминного азота.
В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают точную навеску (указывают в фармакопейной статье) испытуемого образца, прибавляют 4 мл воды, 0,5 мл тимолфталеина раствора 0,1%, перемешивают и по каплям прибавляют натрия гидроксида раствор 0,5 М до слабого голубого окрашивания. Прибавляют 20 мл суспензии меди фосфата, перемешивают. При исчезновении осадка прибавляют еще 5 мл суспензии меди фосфата, объем раствора в колбе доводят водой до метки, перемешивают и фильтруют через плотный бумажный фильтр (синяя лента). Фильтрат должен быть прозрачным. Отбирают 10 мл фильтрата в коническую колбу, прибавляют 0,4 мл уксусной кислоты ледяной, прибавляют 7,5 мл калия йодида раствора 10% и выделившийся йод титруют натрия тиосульфата раствором 0,01 М. В конце титрования, когда раствор примет соломенно-желтую окраску, прибавляют 1,5 мл раствора крахмала и продолжают титрование до исчезновения появившейся синей окраски.
Параллельно проводят контрольный опыт.
1 мл натрия тиосульфата раствора 0,01 М соответствует 0,28 мг аминного азота.
Примечания.
1. Приготовление раствора меди(II) хлорида. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 27,3 г меди(II) хлорида, растворяют в 500 мл воды, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
2. Приготовление раствора натрия фосфата.
А) 68,5 г натрия фосфата додекагидрата помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, растворяют в 500 мл воды, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают;
или
Б) 64,5 г динатрия гидрофосфата додекагидрата помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, растворяют в 500 мл воды, освобожденной от углерода диоксида кипячением, прибавляют 7,2 г натрия гидроксида, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
3. Приготовление боратного буферного раствора. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 28,6 г натрия тетрабората, растворяют в 750 мл воды, прибавляют 50 мл хлористоводородной кислоты раствора 1 М, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают (рН 8,8).
4. Приготовление суспензии меди фосфата. Смешивают один объем раствора меди(II) хлорида с двумя объемами раствора натрия фосфата и двумя объемами боратного буферного раствора.
Раствор готовят перед использованием.